62/2000 शिशुओं और छोटे बच्चों के स्वास्थ्य की रक्षा करें! वांयी आयन क्रोमैटोग्राफी सात प्रकार के मानव दूध का निर्धारण करती है

प्रस्तावना

मानव दूध ऑलिगोसेकेराइड्स (एचएमओ) ऑलिगोसेकेराइड्स का एक समूह है, जिसमें पोलीमराइजेशन की डिग्री 3 से अधिक नहीं होती है, जो स्वाभाविक रूप से मानव दूध में मौजूद होती है; वे मानव दूध में लैक्टोज़ और वसा के बाद तीसरा सबसे बड़ा ठोस घटक हैं। वे आंतों के वनस्पतियों को नियंत्रित करते हैं - विशेष रूप से शिशु आंत में बिफीडोबैक्टीरियासी के उपनिवेशण को बढ़ावा देते हैं - साथ ही आंतों के स्वास्थ्य को बनाए रखते हैं, प्रतिरक्षा और मस्तिष्क के विकास का समर्थन करते हैं, और संक्रामक विरोधी प्रभाव डालते हैं, शिशु विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। 2015 में संयुक्त राज्य अमेरिका में पहला एचएमओ-फोर्टिफाइड शिशु फार्मूला लॉन्च होने के बाद से, दुनिया भर में शिशु फार्मूला, दूध और डेयरी उत्पाद, पाचन-स्वास्थ्य पूरक और एचएमओ युक्त कार्यात्मक खाद्य पदार्थों की एक विस्तृत श्रृंखला बेची गई है। 1 जून, 2023 तक, अमेरिका और यूरोपीय संघ ने उपयोग के लिए सात एचएमओ को मंजूरी दे दी है: 2'-फ्यूकोसिलेक्टोज, 3'-फ्यूकोसिलेक्टोज, डिफ्यूकोसिलेक्टोज, लैक्टो-एन-नियोटेट्राज, लैक्टो-एन-टेट्राज, 3'-सियालीलैक्टोज और 6'-सियालीलैक्टोज।

सामान्य एचएमओ पता लगाने के तरीकों में, तरल क्रोमैटोग्राफी का पता लगाने से पहले एक व्युत्पन्न प्रतिक्रिया की आवश्यकता होती है, इसमें जटिल नमूना तैयार करना शामिल होता है, और व्युत्पन्न अभिकर्मक अक्सर विषाक्त होते हैं; एचएमओ की ताप-योग्य प्रकृति भी एलसी-एमएस में कम प्रतिक्रिया और खराब पुनरावृत्ति की ओर ले जाती है। इसके विपरीत, कार्बोहाइड्रेट के लिए एम्परोमेट्रिक पहचान के साथ आयन क्रोमैटोग्राफी सरल नमूना तैयारी, उच्च प्रतिक्रिया और अच्छी पुनरावृत्ति प्रदान करती है, जिससे एचएमओ विश्लेषण के लिए स्पष्ट लाभ मिलता है। यह एप्लिकेशन नोट एलुएंट्स के रूप में मैन्युअल रूप से तैयार सोडियम हाइड्रॉक्साइड, सोडियम एसीटेट और अल्ट्राप्योर पानी का उपयोग करता है, और शिशु फार्मूला में एचएमओ निर्धारित करने के लिए WAYEAL IC6300 आयन क्रोमैटोग्राफ का उपयोग करता है। इस विधि में सरल नमूना तैयार करना, उच्च संवेदनशीलता और अच्छी रैखिकता शामिल है, जो खाद्य पदार्थों में एचएमओ का पता लगाने के लिए एक उपयोगी संदर्भ प्रदान करती है।

खोजशब्द: आयन क्रोमैटोग्राफ; मानव दूध ओलिगोसेकेराइड; एम्परोमेट्रिक डिटेक्टर।

1. उपकरण, उपकरण और अभिकर्मक

1.1 अभिकर्मक और मानक

तालिका 1. अभिकर्मकों और मानकों की सूची

1.2 प्रयोगशाला सामग्री और सहायक उपकरण

• 1.2.1 विश्लेषणात्मक संतुलन (0.1 मिलीग्राम पठनीयता);
• 1.2.2 थर्मास्टाटिक जल स्नान;
• 1.2.3 अपकेंद्रित्र;
• 1.2.4 जलीय पॉलीइथर्सल्फोन (पीईएस) झिल्ली फिल्टर (0.45 µm);
• 1.2.5 अल्ट्राप्योर पानी;
• 1.2.6 वैक्यूम निस्पंदन उपकरण;
• 1.2.7 आरपी सॉलिड-फेज एक्सट्रैक्शन (एसपीई) प्रीट्रीटमेंट कार्ट्रिज;
• 1.2.8 डिस्पोजेबल सीरिंज (20 एमएल, 5 एमएल)।

2. प्रायोगिक विधि

2.1 समाधान तैयार करना

• 2.1.1 200 एमएमओएल/एल सोडियम हाइड्रॉक्साइड समाधान: 50% NaOH का 10.5 एमएल पिपेट, 1000 एमएल तक पानी के साथ पतला करें, और वैक्यूम के तहत फ़िल्टर करें।
• 2.1.2 75 mmol/L NaOH और 250 mmol/L सोडियम एसीटेट का मिश्रित घोल: 20.51 ग्राम सोडियम एसीटेट को सटीक रूप से तौलें, पानी में घोलें और 1000 mL वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में स्थानांतरित करें; 50% NaOH के 3.95 एमएल को सटीक रूप से पिपेट करें, अल्ट्राप्योर पानी के साथ 1000 एमएल तक पतला करें, और वैक्यूम के तहत फ़िल्टर करें।
• 2.1.3 3% सल्फोसैलिसिलिक एसिड घोल: 3.0 ग्राम सल्फोसैलिसिलिक एसिड का वजन करें, पानी में घोलें और 100 एमएल तक पतला करें (ताजा तैयार करें)।
• 2.1.4 मिश्रित मानक स्टॉक समाधान: 2'-फ्यूकोसिलेक्टोज, 3'-फ्यूकोसिलेक्टोज, 3'-सियालीलैक्टोज, 6'-सियालीलैक्टोज, लैक्टो-एन-टेट्रोज और लैक्टो-एन-नियोटेट्रोज (निकटतम 0.1 मिलीग्राम) में से प्रत्येक को 5 मिलीग्राम सटीक रूप से तौलें, 10 एमएल वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में रखें, पानी में घोलें और तैयार करने के लिए निशान तक पतला करें 500 मिलीग्राम/लीटर मिश्रित स्टॉक। 1 मिलीग्राम डिफ्यूकोसिलेक्टोज (निकटतम 0.1 मिलीग्राम) को अलग से तौलें, 10 एमएल वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में रखें, घोलें और 100 मिलीग्राम/लीटर स्टॉक तैयार करने के लिए निशान तक पतला करें।
• 2.1.5 मिश्रित मानक कार्यशील समाधान: मिश्रित स्टॉक घोल (2.1.4) को सटीक रूप से वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में पिपेट करें और 2'-एफएल, 3'-एफएल, 3'-एसएल, 6'-एसएल, एलएनटी, एलएनटी और डीएफएल के मिश्रित कार्यशील समाधान को 0.5, 2, 4, 6, 8 और 10 मिलीग्राम/लीटर पर तैयार करने के लिए पानी से पतला करें। उपयोग से पहले ताजा तैयार करें।

2.2 नमूना तैयार करना

एक छोटे बीकर में लगभग 2.0 ग्राम नमूना तौलें, 50 एमएल गर्म पानी (लगभग 50 डिग्री सेल्सियस) के साथ अच्छी तरह मिलाएं, 40 एमएल 3% सल्फोसैलिसिलिक एसिड घोल डालें, एक वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में 100 एमएल तक स्थानांतरित करें और पतला करें, और 10 मिनट के लिए सोनिकेट करें। फिल्टर पेपर या सेंट्रीफ्यूज के माध्यम से फ़िल्टर करें (12,000 आर/मिनट, 15 मिनट)। नमूना समाधान को आरपी एसपीई कार्ट्रिज और फिर 0.45 µm जलीय झिल्ली फिल्टर से गुजारें; पहले 3 एमएल को त्यागें और विश्लेषण के लिए इलुएट एकत्र करें। उपयोग से पहले, आरपी एसपीई कार्ट्रिज को 20 एमएल मेथनॉल और उसके बाद 15 एमएल पानी से कंडीशन करें और 30 मिनट के लिए संतुलित करें।

2.3 प्रायोगिक स्थितियाँ

2.3.1 आयन क्रोमैटोग्राफी स्थितियाँ

3. परिणाम

3.1 रैखिक रेंज

प्रत्येक मिश्रित मानक कार्यशील समाधान के एक उपयुक्त विभाज्य का विश्लेषण किया गया। रैखिक सीमा 0.5-10 मिलीग्राम/लीटर थी; मापी गई और नाममात्र सांद्रता के बीच विचलन अधिकतम स्वीकार्य विचलन के भीतर था, आर² मान 0.999 से ऊपर थे, और सभी घटकों ने अच्छी रैखिकता दिखाई।

तालिका 2. यौगिकों की रैखिक श्रेणियाँ

चित्र 1. सात एचएमओ मानकों के मढ़ा अंशांकन क्रोमैटोग्राम

3.2 नमूना परीक्षण परिणाम

नमूने 1 और 2 का परीक्षण 10 गुना कमजोर पड़ने के बाद किया गया। सात एचएमओ में से प्रत्येक की सामग्री की गणना निम्नानुसार की गई थी: एक्स नमूने में सामग्री है (मिलीग्राम/100 ग्राम); सी अंशांकन वक्र (मिलीग्राम/एल) से नमूना समाधान में एकाग्रता है; V स्थिर आयतन (mL) है; मी नमूना द्रव्यमान (जी) है; f तनुकरण कारक है। गणना की गई सामग्री (मिलीग्राम/100 ग्राम) इस प्रकार है:

चित्र 2. नमूना 1 का आयन क्रोमैटोग्राम 10 गुना पतला

चित्र 3. नमूना 2 का आयन क्रोमैटोग्राम 10 गुना पतला

तालिका 3. नमूना परीक्षण परिणाम

3.3 परिशुद्धता

चौथे अंशांकन स्तर पर कार्यशील समाधान का 2.3.1 की शर्तों के तहत लगातार छह इंजेक्शनों में विश्लेषण किया गया था। सात एचएमओ सामग्रियों के आरएसडी की गणना पुनरावृत्ति का मूल्यांकन करने के लिए की गई थी। नीचे दिए गए परिणाम अच्छी विधि परिशुद्धता दर्शाते हैं।

3.3.1 मानक पुनरावृत्ति परिशुद्धता

परीक्षा के परिणाम:

चित्र 4. अंशांकन मानक S4 के स्वतंत्र प्रतिकृति इंजेक्शन के मढ़ा क्रोमैटोग्राम

तालिका 4. मानक की पुनरावृत्ति परिशुद्धता

3.4 जांच और मात्रा की सीमाएँ

एलओडी: मानक समाधान के एलिकोट्स को 10 µg/L 3'-FL, 30 µg/L DFL, 30 µg/L 2'-FL, 22 µg/L LNnT, 67 µg/L LNT, 67 µg/L 6'-SL और 160 µg/L 3'-SL युक्त मिश्रित घोल में पतला किया गया था; 20 समानांतर नमूने तैयार किए गए और उनका विश्लेषण किया गया।

LOQ: मानक समाधान के अंशों को 30 µg/L 3'-FL, 80 µg/L DFL, 90 µg/L 2'-FL, 65 µg/L LNnT, 200 µg/L LNT, 200 µg/L 6'-SL और 500 µg/L युक्त मिश्रित घोल में पतला किया गया था। 3'-एसएल; छह समानांतर नमूने तैयार किए गए और उनका विश्लेषण किया गया।

परीक्षण के परिणाम इस प्रकार हैं:

तालिका 5. सात एचएमओ के एलओडी और एलओक्यू के लिए एस/एन परिणाम

3.5 विशिष्टता

ग्लूकोज, फ्रुक्टोज, सुक्रोज और माल्टोज मानक समाधानों के एलिकोट्स (प्रत्येक 100 μL) को 10 एमएल वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क में जोड़ा गया और नमूना 2 समाधान के साथ 67 गुना पतला किया गया। समाधान का विश्लेषण यह जांचने के लिए किया गया था कि क्या ये शर्करा सात एचएमओ के शिखर में हस्तक्षेप करती है। जैसा कि नीचे दिखाया गया है, चार शर्कराओं ने दूध पाउडर में सात एचएमओ के निर्धारण में कोई महत्वपूर्ण हस्तक्षेप नहीं दिखाया।

चित्र 5. चार चीनी मानकों के साथ अंशांकन एस6, नमूना 2, और नमूना 2 के मढ़ा क्रोमैटोग्राम

4. निष्कर्ष

इस सत्यापन में खाद्य पदार्थों में एचएमओ निर्धारित करने की विधि को सत्यापित करने के लिए WAYEAL आयन क्रोमैटोग्राफ का उपयोग किया गया। डेटा से पता चलता है कि सभी क्रोमैटोग्राफ़िक चोटियाँ बिना पूंछ के अच्छे आकार की हैं; 2'-एफएल, 3'-एफएल, डीएफएल, एलएनएनटी, एलएनटी, 6'-एसएल और 3'-एसएल सभी 60 मिनट के भीतर समाप्त हो जाते हैं; संवेदनशीलता राष्ट्रीय मानक आवश्यकताओं को पूरा करती है; और रैखिक सहसंबंध गुणांक सभी 0.999 से अधिक हैं। मानकों और नमूनों दोनों की पुनरावृत्ति अच्छी है। दो सियालिलैक्टोज़ को छोड़कर, LOD और LOQ µg/L स्तर पर हैं। विधि में अच्छी विशिष्टता है, इसमें कोई हस्तक्षेप करने वाली अशुद्धियाँ नहीं पाई जाती हैं, और कुल मिलाकर यह मानक आवश्यकताओं को पूरा करती है।