वेयेल एलसीएमएस-टीक्यू9200 लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री सिस्टम का उपयोग करके एंटीबायोटिक किण्वन अवशेषों में एरिथ्रोमाइसिन अवशेषों का निर्धारण

एरिथ्रोमाइसिन एक मैक्रोलाइड एंटीबायोटिक है जो स्ट्रेप्टोमाइसेस एरिथ्रियस के किण्वन से उत्पन्न होता है। यह मुख्य रूप से जीवाणु प्रोटीन संश्लेषण को बाधित करके अपना जीवाणुरोधी प्रभाव डालता है। एरिथ्रोमाइसिन उत्पादन मुख्य रूप से जैव-किण्वन तकनीक पर निर्भर करता है, जिसमें तनाव चयन, बीज संस्कृति, टैंकों में बड़े पैमाने पर किण्वन, निष्कर्षण और शुद्धिकरण जैसे चरण शामिल हैं। किण्वन के बाद, एरिथ्रोमाइसिन को कार्बनिक सॉल्वैंट्स (जैसे ब्यूटाइल एसीटेट) के साथ निकाला जाता है, इसके बाद क्रिस्टलीकरण या आयन-एक्सचेंज राल पृथक्करण के माध्यम से शुद्धिकरण किया जाता है, जिससे अंततः नैदानिक ​​ग्रेड के लवण (जैसे, एरिथ्रोमाइसिन एथिलसक्सिनेट) प्राप्त होते हैं। हालाँकि, एरिथ्रोमाइसिन उत्पादन प्रक्रिया बड़ी मात्रा में माइसीलियल ड्रेग्स (किण्वन अवशेष) उत्पन्न करती है, जिसमें अवशिष्ट एंटीबायोटिक्स, माइक्रोबियल प्रोटीन और मेटाबॉलिक उप-उत्पाद हो सकते हैं। यदि ठीक से प्रबंधित नहीं किया जाता है, तो ये अवशेष पर्यावरणीय निर्वहन या फ़ीड एडिटिव्स के रूप में उपयोग के माध्यम से पारिस्थितिक श्रृंखला में प्रवेश कर सकते हैं, जिससे कई खतरे पैदा हो सकते हैं: अवशिष्ट एरिथ्रोमाइसिन मिट्टी और जल निकायों में एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के प्रसार को बढ़ावा दे सकता है, जिससे माइक्रोबियल समुदाय संतुलन बाधित होता है; खाद्य श्रृंखला के माध्यम से प्रवर्धित, यह जानवरों या मनुष्यों में प्रतिरोधी जीवाणु उपभेदों के उद्भव को प्रेरित कर सकता है, जिससे एंटीबायोटिक प्रभावकारिता कम हो जाती है; इसके अतिरिक्त, अवशेषों के भीतर अप्रयुक्त कार्बनिक पदार्थ पर्यावरण प्रदूषण का कारण बन सकते हैं। इसलिए, माइसीलियल अवशेष का सख्त विनियमन एरिथ्रोमाइसिन उत्पादन से प्रदूषण को नियंत्रित करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपाय है।

यह प्रयोग मानक "टी/पीआईएसी 00003—2021 चाइना फार्मास्युटिकल इंडस्ट्री एसोसिएशन का समूह मानक - एंटीबायोटिक अवशेष, कार्बनिक उर्वरक आधार सामग्री, फसलों और पर्यावरणीय मीडिया में एरिथ्रोमाइसिन के निर्धारण की विधि" के संदर्भ में आयोजित किया गया था, जिसमें माइसीलियल ड्रेग्स में एरिथ्रोमाइसिन की मात्रा निर्धारित करने के लिए वेयियल एलसीएमएस-टीक्यू9200 लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री सिस्टम का उपयोग किया गया था। प्रायोगिक परिणाम बताते हैं कि सिस्टम उपयुक्तता परीक्षण ने अच्छी पीक आकृति और अच्छी रैखिकता का प्रदर्शन किया, जो प्रायोगिक आवश्यकताओं को पूरा करता है।

1. उपकरण और अभिकर्मक

1.1 एलसीएमएस की विन्यास सूची

तालिका 1 उपकरण विन्यास की सूची

1.2 अभिकर्मक और मानक

तालिका 2 अभिकर्मक और मानकों की सूची

1.3 प्रयोग सामग्री और सहायक उपकरण

अल्ट्रासोनिक क्लीनर

वॉर्टेक्स मिक्सर

हाई-स्पीड सेंट्रीफ्यूज

2. प्रयोग विधि

2.1 नमूना पूर्व-उपचार

0.5 ग्राम नमूना (0.001 ग्राम तक सटीक) को एक कांच-स्टॉपर वाली टेस्ट ट्यूब में तौलें। 50mL एसीटोनिट्राइल डालें, मिश्रण को होमोजेनाइज करने के लिए 1 मिनट के लिए वर्टेक्स करें, और 20 मिनट के लिए अल्ट्रासोनिक-सहायता प्राप्त निष्कर्षण करें। फिर मिश्रण को 50mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 10 मिनट के लिए 4000rpm पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनेटेंट की एक उपयुक्त मात्रा एकत्र करें और इसे 0.22μm फिल्टर झिल्ली से गुजारें। कम से कम 1mL प्रारंभिक निस्पंदन को त्यागें, फिर शेष निस्पंदन को विश्लेषण के लिए एक एम्बर एलसी शीशी में स्थानांतरित करें।

2.2 प्रयोग की शर्तें

2.2.1 लिक्विड क्रोमैटोग्राफी विधि की शर्तें

क्रोमैटोग्राफी कॉलम: C18 1.7μm 2.1x50mm

मोबाइल चरण: A: एसीटोनिट्राइल, B: पानी में 0.1% फॉर्मिक एसिड

प्रवाह दर: 0.3mL/min

कॉलम तापमान: 30℃

इंजेक्शन वॉल्यूम: 2μL

2.2.2 मास स्पेक्ट्रोमीटर विधि की शर्तें

तालिका 3 मास स्पेक्ट्रोमेट्री आयन स्रोत पैरामीटर

3. प्रयोग परिणाम

3.1 सिस्टम उपयुक्तता परीक्षण

सिस्टम उपयुक्तता परीक्षण के परिणामों में बाहरी चोटियों से हस्तक्षेप के बिना अच्छी तरह से परिभाषित लक्ष्य चोटियाँ दिखाई गईं, जो सभी प्रायोगिक आवश्यकताओं को पूरा करती हैं।

चित्र 1 एरिथ्रोमाइसिन ए स्टैंडर्ड वर्किंग सॉल्यूशन (0.5ng/mL) का क्रोमैटोग्राम

3.2 रैखिक सीमा

एरिथ्रोमाइसिन ए के लिए अंशांकन वक्र को मध्यवर्ती सांद्रता वाले वर्किंग सॉल्यूशन का उपयोग करके मानक सॉल्यूशन को क्रमिक रूप से पतला करके तैयार किया गया था। वक्र ने 0.5-500ng/mL की सीमा में उत्कृष्ट रैखिकता का प्रदर्शन किया, जिसमें सहसंबंध गुणांक (R²) 0.99 से अधिक था।

तालिका 4 एरिथ्रोमाइसिन ए की रैखिक सीमा

चित्र 2 एरिथ्रोमाइसिन ए के लिए अंशांकन वक्र

3.3 पता लगाने की सीमा (एलओडी) और मात्रा का निर्धारण (एलओक्यू) की सीमा

इस विधि में, एरिथ्रोमाइसिन ए स्टैंडर्ड सॉल्यूशन के लिए पता लगाने की सीमा (एलओडी) और मात्रा का निर्धारण (एलओक्यू) की सीमा क्रमशः 0.2ng/mL और 0.5ng/mL निर्धारित की गई थी। संबंधित सिग्नल-टू-शोर अनुपात (एस/एन) 110.02 और 292.20 थे, जो 3 और 10 की न्यूनतम आवश्यकताओं से काफी अधिक थे, जिससे प्रायोगिक संवेदनशीलता मानदंड पूरे हो गए।

चित्र 3. एरिथ्रोमाइसिन ए के एलओडी और एलओक्यू के लिए निकाले गए आयन क्रोमैटोग्राम

3.4 परिशुद्धता परीक्षण

एरिथ्रोमाइसिन ए सॉल्यूशन को लगातार सात बार इंजेक्ट किया गया, जिसके परिणाम नीचे दिए गए चित्र में दिखाए गए हैं। एरिथ्रोमाइसिन ए के लिए प्रतिधारण समय विचलन 0.19% था, और पीक क्षेत्र विचलन 0.96% था, दोनों ही 5% से कम हैं, जो प्रायोगिक आवश्यकताओं को पूरा करते हैं।

चित्र 4. एरिथ्रोमाइसिन ए नमूना (7 इंजेक्शन) के परिशुद्धता क्रोमैटोग्राम

3.5 नमूना परीक्षण

पूर्व-उल्लिखित पूर्व-उपचार विधि का पालन करते हुए, ठोस नमूने में लक्ष्य पीक क्षेत्र 7.4E6 था। बाहरी मानक विधि के माध्यम से गणना की गई, नमूना सॉल्यूशन में एरिथ्रोमाइसिन ए की मात्रा 400 ng/mL निर्धारित की गई।

चित्र 5 एरिथ्रोमाइसिन ए नमूना परीक्षण का क्रोमैटोग्राम

4. निष्कर्ष

यह विधि एंटीबायोटिक किण्वन अवशेषों में एरिथ्रोमाइसिन ए की मात्रा के निर्धारण के लिए वेयियल एलसीएमएस-टीक्यू9200 लिक्विड क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री सिस्टम का उपयोग करती है। डेटा इंगित करते हैं कि विधि उत्कृष्ट प्रदर्शन करती है: सभी क्रोमैटोग्राफिक चोटियाँ बिना पूंछ के इष्टतम आकार प्रदर्शित करती हैं, और संवेदनशीलता प्रायोगिक आवश्यकताओं को पूरा करती है। रैखिक सहसंबंध गुणांक (R²) 0.99 से अधिक है। सात लगातार इंजेक्शन में सभी यौगिकों के लिए प्रतिधारण समय और पीक क्षेत्र विचलन 1% के भीतर है, जो उच्च परिशुद्धता का संकेत देता है। नमूना क्रोमैटोग्राम बाहरी चोटियों से कोई हस्तक्षेप नहीं दिखाते हैं, और मापा गया नमूना सामग्री 400ng/mL है। वेयियल एलसी-एमएस/एमएस सिस्टम से लैस यह विधि, परीक्षण नमूनों के नियमित गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण की आवश्यकताओं को पूरा करती है।